预防兽医学复习题汇总(三)
参考来源:百度文库 作者:秩名 更新时间:2016年02月03日 23时59分

12.我国动物源性耐药性研究的进展。
1.我国兽用抗菌药物耐药性的现状 抗菌药在养殖业的大量使用,随之而来的是抗菌药耐药性不断产生并越来越严重。国内对兽医领域抗菌药的耐药性缺乏有计划和系统的监测,所以,对我国兽用抗菌药的耐药性情况很难做出准确的评价。但总的来说,由于抗菌药的滥用和不合理应用十分普遍,故耐药性是相当严重的。许多临床工作者反映抗菌药的效果比以前差,用药剂量不断加大,这虽然是临床工作者的反映,但也从一个侧面反映了耐药性的严重。
2.对兽用抗菌药物耐药性的研究
2.1大肠杆菌I型整合子/耐药基因盒的分子流行病学调查 细菌基因盒-整合子系统(genecassette-integronsystem)是20世纪90年代新发现的可移动的基因元件(Hall,1991)。以上述分离的大肠杆菌耐药菌株为标本,用常规PCR方法扩增整合酶基因对I型整合子流行情况进行了调查,并以TD-PCR扩增、同源性酶谱分析及直接测序相结合的方法调查整合子插入耐药基因盒的种类,研究猪场大肠杆菌I型整合子/耐药基因盒的分子流行病学。结果表明,猪场大肠杆菌I型整合子流行较普遍,192株分离菌中有105株携带I型整合子,检出率为54.7%,I型整合子多数位于质粒上;猪场大肠杆菌存在6种I型整合子流行,其中整合二氢叶酸还原酶(dhfr)和氨基糖腺苷转移酶(aadA2)两种耐药基因的I型整合子流行最普遍,检出率达36.6%。从不同来源分离的大肠杆菌,发现以小猪群分离菌的I型整合子检出率最高,饲养员最低。比较还发现,菌株携带整合子及耐药基因盒的情况与其耐药谱及多重耐药表型有密切关系,敏感菌、单耐药及二耐药菌株几乎不存在I型整合子和耐药基因盒,而耐受3种抗菌药物以上的多重耐药菌株,I型整合子和耐药基因盒检出率显著提高,提示I型整合子可能与细菌的多重耐药有关(吴聪明,2003)。
2.2耐氟喹诺酮类大肠杆菌gyrA基因突变研究 从患有大肠杆菌病的动物分离大肠杆菌,并对其进行生化鉴定。按常规方法测定其对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、麻保沙星的MIC,筛选出5株MIC为4~128mg/l的耐药菌株(其中猪源2株、鸡2株、犬1株)。同时,用亚MIC连续递增法传代培养获得禽大肠杆菌(O78)和猫大肠杆菌对恩诺沙星的高度耐药菌各1株(MIC分别为64mg/l和8mg/l)。从7株耐药菌提取DNA,经PCR扩增并分别进行测序,将测序结果与文献发表的大肠杆菌敏感株的gyrA基因的相应区域进行同源性分析。结果表明,各菌株均在第83位和87位的氨基酸上发生了突变,同源性都是98.3%,其中犬源耐药菌的突变为Ser83→Leu,Asp87→Tyr;其余6株耐药菌的突变均为Ser83→Leu,Asp87→Asn。这两个突变位点与文献报道的耐药决定区的突变相同,预示gyrA基因Ser83和Asp87突变可能参与构成大肠杆菌对氟喹诺酮类的耐药机制(廖晓萍,2002)。
2.3耐氟喹诺酮类鸡毒支原体gyrA的基因突变研究 对临床分离的3株鸡毒支原体(FL、HS1和HS2)和实验室经恩诺沙星和环丙沙星诱导的2株支原体(S6-10和F14-8)对6种氟喹诺酮类药物恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星和麻保沙星测定其MIC,均表现不同程度的耐药,其MIC范围为2~32μg/ml。对上述菌株提取DNA,经酶切鉴定和质粒PCR鉴定,确认转化子含有gyrA基因目的片段后,进行测序并用DNASIS分析软件对测序结果进行分析。结果显示,临床分离的3株鸡毒支原体中,1株在gyrA亚基QRDR未发生任何取代,2株则在第83位有一相同的氨基酸取代(Ser83→Ile),其中1株还发生第87位取代(Glu87→Gly),诱导的2株耐药菌,S6-10株在恩诺沙星药物压力下获得的耐药株最常见的突变位点是gyrA第83位(Ser83→Ile),高水平耐药株在第82位增加1个氨基酸取代位点(Asp82→Gly),但在第87位不发生任何取代;而S6-10株在环丙沙星药物压力下获得的耐药株首先在第87位发生突变(Glu87→Gln/Gly),高水平耐药株在第83位增加1个突变位点(Ser83→Ile)。F14-8株在两种药物压力诱导下产生的耐药株最常见的突变位点是gyrA第87位(Glu87→Gln/Gly),高水平耐药侏在第83位增加1个氨基酸取代位点(Ser83→Ile)。在发现上述耐药株突变位点的同时,对部分较低水平耐药的菌株却未发现gyrA的任何位点突变,暗示可能存在其他突变位点或耐药机制,尚待进一步研究(蒋红霞,2002)。
2.4耐氟喹诺酮类猪源沙门氏菌gyrA基因突变研究 从广东某猪场分离3株高水平耐氟喹诺酮类药物的沙门氏菌(MIC764μg/ml),通过PCR方法扩增gyrA基因片段,然后进行克隆测序。结果表明,3株沙门氏菌均发生Ser83(TCC)→Phe(TTC)及Asp87(GAC)→Asn(AAC)突变,其中1株还发生了His78(CAT)→Tyr(TAT)的突变,国内外尚未见报道,这一突变位点对耐药性的意义,有待进一步的研究。由此可见,高度耐药的猪霍乱沙门氏菌的gyrA基因可发生双位点突变,个别菌株还可能发生3位点突变。由于测定的菌株不多,上述结果尚待进一步重复验证.
3.动物源细菌耐药性的扩散与传递 从对大肠杆菌耐药性的调查结果,各类养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌耐药性趋势分存均很相似,而且三种来源的大肠杆菌之间还存在不少相同耐药谱的多耐药菌株,尤其是动物源及环境源的分离菌更为接近,这表明耐药菌在动物、环境和饲养员之间可能存在扩散、传递现象。虽然许多现象表明耐药菌株的耐药因子可以通过某种机制传递给人类病原菌,但动物源细菌耐药性可否向人类病原菌传递的问题一直存在着争论。据Hunter报道,从应用安普霉素(apramycin)多年的猪场的仔猪粪便,周围环境和牧场主的粪便中均分离到耐安普霉素的大肠杆菌,这些耐药菌株中都含有一个相似的大约为62kb的耐药质粒,而且这些质粒可以互相传递。国内这方面的研究报道很少,只有胡子鉴曾通过大肠杆菌耐药谱调查和脉冲场凝胶电泳比较相同或相似耐药谱之间的亲缘关系,结果发现同一养殖场不同动物个体及饲养员相同或相近耐药谱的菌株,其脉冲场凝胶电泳指纹相似,因此认为同处一环境对氟喹诺酮类耐药的大肠杆菌可能由克隆传播造成的。
  关于细菌耐药性的扩散机制和方式,国际上已经作了非常广泛深入的研究,细菌除通过基因突变获得耐药性外,还可通过携带可转移遗传因子包括质粒、转座子和噬菌体等使耐药性扩散传播。20世纪90年代又发现了细菌耐药性的整合子/基因盒系统(Hall,1991),根据我们的调查,猪场分离的大肠杆菌I型整合子及耐药基因盒检出率达54.7%,而且携带两个整合子的现象较普遍,占整盒子检出率的15.2%,由于整盒子潜在的基因捕获及整合表达能力,将来可能会更广泛流行,尤其是在药物选择压力持续作用下,这种可能性更大,对细菌耐药性的传播可能是一种严重的威胁。
13.细菌对临床常用抗菌药物耐药机制的研究进展。
(1)灭活酶和钝化酶的产生。细菌能产生可破坏抗菌药物或使之失去抗菌作用的酶,使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。如β-内酰胺酶,氨基糖苷类钝化酶,氯霉素乙酰转移酶,红霉素酯酶和其它灭活酶。
(2)抗菌药物渗透障碍
(3)主动外排耐药机制
(4)药物作用靶位的改变
(5)代谢途径或代谢状态改变
14.禽流感病毒的致病性和毒力主要有哪些基因决定的,这些基因的主要功能有哪些?
(1.)HA基因
HA与细胞受体结合后,病毒被内吞到细胞中,病毒囊膜与吞噬小体进行膜融合时需要HA蛋白裂解为HA1和HA2,在HA2上形成膜融合区来诱导融合的发生。
HA:HA蛋白即血凝素蛋白,由片段4编码,是典型的1型糖蛋白,是流感的主要表面抗原之一。HA在感染过程中呗水解为HA1,HA2两条,他是感染细胞的先决条件;HA蛋白具有良好的免疫原性,能诱导机体产生中和抗体;也是病毒发生抗原变异的主要蛋白之一,可以帮助病毒逃脱免疫系统的监视,是A型流感病毒致病性的主要决定因素。
(2.)NA基因
NA是一种唾液酸酶,可以在病毒感染靶细胞时,识别细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基,使病毒能够进入细胞。NA的另一个功能是为要出芽的病毒粒子清理通道,有利于病毒粒子的成熟和释放。
NA:神经氨酸由片段6编码,是除血凝素基因外另一个主要的表面抗原。NA可特异性裂解细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基,为病毒粒子从感染的细胞中释放出来创造条件。此外,NA蛋白还具有良好的免疫原性,能诱导机体产生相应的中和抗体。
(3)M基因
M1和M2是由M基因编码的,M1蛋白是病毒粒子中最丰富的蛋白,在病毒粒子出芽和装配过程中起着关键性的作用。
M:基质蛋白M是病毒粒子中含量最多的蛋白,由片段7编码,由M1,M2两种蛋白组成,具有特异性,是划分流感病毒型的主要依据之一。M蛋白在病毒感染早期可影响病毒的生长速度及子代病毒的装配。M1构成病毒粒子蛋白质外壳的主要成分,可以调节子代病毒颗粒的装配,并稳定颗粒核心部分;M2蛋白可诱导抑制是病毒复制的抗体,是CTL的靶抗原。
(4.)NS基因
NS1与dsRAN结合抑制IFN-α/β的转录调控因子的激活从而在流感病毒抗宿主免疫学反应和致病性中起主要作用。
NS:是非结构蛋白,由片段8编码NS1,NS2两种蛋白。NS1可帮助病毒逃离宿主免疫反应。
(5.)PB2基因
病毒的复制蛋白与病毒的复制有关,特别是627位点的改变对病毒的毒力有重大影响。
PB2:与流感病毒的宿主限制性及致病性密切相关。有资料表面其627位氨基酸对禽流感病毒感染动物种属特异性具有决定性作用。
(6.)NP基因NP蛋白是流感病毒粒子中主要的结构蛋白,NP蛋白上有亲核信号,与cRNA和vRNA形成复合物引导她们向细胞核定向移动。
NP:蛋白是一种核蛋白,由片段5编码,具有型特异性,与聚合酶蛋白和vRNA结合形成核糖核蛋白颗粒RNP,可以稳定vRNA,防止被RNA酶的降解,而且还参与病毒基因组的复制和转录,在决定病毒的宿主范围上也起着重要的作用。

此外,PB1:PB1基因还编码PB1-F2,该蛋白具有通过诱导巨噬细胞凋亡降低宿主的免疫反应;介导细胞杀伤作用阻碍抗原递呈细胞对后天免疫的调节而增加继发细菌感染的可能性,从而使病毒的致病性增加;同时诱导细胞凋亡。
PB2、PB1、PA分别由片段1,2,3编码,共同组成了流感病毒的RNA聚合酶复合物,发挥RNA酶的作用,负责mRNA和vRNA的复制和转录。
注:黑体字只需在论述题答,简答题只需答非黑体字部分。
15.动物RNA病毒的反向遗传系统的建立方法有几种?每种方法各有什么优缺点?
答:1)以T7RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统
① 以表达T7RNAP的痘病毒为基础的体内拯救系统及缺点
优点:T7RNAP能够有效地促进大量RNA在体内进行转录,这些RNA都是在哺乳动物细胞的细胞质中,通过T7RNAP控制T7启动子而启动转录的。
缺点:T7RNAP痘毒株系统由于痘病毒株而引起该系统一些缺陷。痘毒株对宿主细胞有致细胞病变作用,子代痘病毒的释放同时也会干扰拯救病毒子代病毒的释放,降低了从克隆DNA中拯救病毒的效率,这也干扰对目的产物的分析。
该系统辅助病毒感染可以产生相对较快的细胞病变效应,从而也会引起病毒拯救困难。在感染细胞期间,致细胞病变效应限制了病毒拯救和在该细胞上病毒繁殖的时间期限。这使得对生长缓慢的高度致弱病毒或病毒载体进行拯救非常困难。辅助病毒的使用还会在拯救过程中引入一种生物学感染性抗原。对这类问题有严格的要求:(l)辅助病毒的起源和传代背景必须被充分的证明;(2)辅助病毒繁殖从来没有经过未知起源牛血清的处理,否则,这可能会使其有暴露于牛的海绵状脑病的危险;(3)在拯救过程中的辅助病毒使用必须严格的被检验,以确保不存在外来抗原的干扰,这些外来抗原可能是通过在牛、猪、或鸟类的衍化物质中暴露而被引入同源重组常常在全长基因组和辅助质粒之间,通过疫苗毒株的DNA聚合酶而频繁发生。
在真核中T7RNAP是否能够维持足够高的活性及建立高效的拯救系统难以保证
② T7RNAP为基础的无痘病毒的拯救系统
优点:不需要考虑子代痘病毒的释放同时也会干拯救病毒子代病毒的释放的问题。具有能够表达充足T7RNAP的稳定细胞系,T7RNAP基因能够稳定的被整合到细胞的基因组中,并且能够在不同的靶细胞内,在没有发生变异的情况下,高水平表达。
缺点:稳定表达T7RNAP的细胞系很难建立和培养。在选择压力下进行传代,很难建立一个不缺失T7RNAP活性的稳定细胞系。此外,该方法在疫苗研制中的应用可能会受到限制,因为用于疫苗候选株的细胞系的确认是很困难的。
要建立具有高效拯救效率的细胞系,还要注意选择合适的逆转录病毒载体,要考虑它的转录启动子的转录效率以及与宿主基因组整合的效率和拷贝数。
2)真核RNA聚合酶Ⅰ拯救系统
优点:RNA聚合酶Ⅰ转录产物5`端不加帽,3’端不加尾,故没有冗余序列。RNA聚合酶Ⅰ是细胞核内含量丰富的酶,它能转录出精确的rRNA(类似于流感病毒的vRNA)。该酶还能在特定的启动子和终止子序列处启动/终止转录,PolⅠ终止子位点高度精确。RNA聚合酶Ⅰ系统比RNP直接转染系统更为有效,因为它能进行体外转录、蛋白质纯化和体外RNP装配。其转染效率较高,原因在于293T细胞具有很高的转染效率,并且细胞中具有足够的RNA聚合酶Ⅰ和较高的转录效率,能随着细胞增殖保证RNA聚合酶工的供给。
缺点:该系统病毒产毒量特别低的缺点。由于RNA聚合酶Ⅰ转录活性具有特异性,在不同宿主和细胞里表现不同活性。
3)真核RNA聚合酶Ⅱ拯救系统
RNA聚合酶Ⅱ位于核质内,它负责合成核不均一RNA(hnRNA),即mRNA的前体。目前商品真核载体绝大多数都是利用RNA聚合酶Ⅱ启动子和终止子序列构建的载体。所用的启动子多数集中在人的巨细胞病毒(humaneytomegalovirus,hCMV)、猿病毒40(simianvirus40,Sv40)等启动子。
优点:除了负链病毒拯救负责合成病毒蛋白外,在正链病毒也有利用。
在病毒基因组cDNA的5’和3’同时引进HDV核酶,这样产生5’不加帽,3’不含有冗余序列的病毒RNA,并在实验中取得不错的效果。
通过转染重组DNA质粒,直接使用真核生物RNAPolⅡ启动子去驱动病毒cDNA转录。
缺点:CMV的转录本5’有帽子结构,影响了病毒RNA的感染性。
利用PolⅡ系统可能带来一级转录本被剪辑的风险,这也可能阻止这个拯救系统对特异的病毒的成功应用。
在病毒基因组cDNA的5’和3’同时引进HDV核酶的切割效率是有限的,它要求在转录本的3’端要有必要的修饰,切割效率低,还有许多病毒基因组两端含有冗余序列也可能是导致该系统拯救效率低的原因。
4)polⅠ-polⅡ双启动子拯救系统
在polI启动子与终止子间插入polⅡ启动子和多聚腺苷酸,再将病毒基因插入该系统,利用细胞酶系统拯救出病毒;
优点:可以在拯救株上引入多个变异位点,减弱毒株活性,研制出安生性更好的弱毒疫苗。拯救效率相对较高。
缺点:拯救的病毒变异可能性大。
16.反向遗传系统在生物医学研究中的应用有哪些?请举例说明。
答:
1)病毒基因功能方面:RNA病毒感染性克隆的构建,突破了对单一基因研究的局限,从病毒整体与分子之间、病毒与宿主关系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置换或构建嵌和病毒等方法对病毒基因功能进行研究。如Nishigahara将G蛋白基因替换事先构建的弱毒株RC-HL反向遗传学系统中相应基因,制备出嵌合病毒。将该嵌合病毒脑内接种小鼠后,与Nishigahara株一样可以引起小鼠死亡。证明G基因是RV毒力决定基因,也表明G蛋白在病毒吸附过程中具有重要作用。比较RC-HL株和Nishigahara株的G蛋白基因后发现242、255、268位的氨基酸发生了变异。在构建的弱毒株RC-HL反向遗传系统中逐步把242、255、268位的氨基酸替换为Nishigahara株的G蛋白基因,发现任何一个氨基酸被替换后致病性都会增加。将弱毒rHEP株G基因333位氨基酸替换为精氨酸后致病性大大增加。进一步证实G蛋白333位氨基酸是毒力决定位点。
2)阐明病毒的起源和致病机制方面:这方面禽流感病毒H5N1株和1918西班牙流感人类及动物RNA病毒株的例子可供借鉴。目前SARS病毒的家猫、雪貂动物模型已经建立,从野生动物上分离到的SARS病毒也测出全序列将来可结合感染性克隆对病毒起源和致病性进行研究。
3)新型疫苗方面:主要有以下几个方面:(1)寻找出与毒力相关位点,通过对毒力决定性基因的缺失或修饰得到一种无毒或减毒毒株,以此制备新型的减毒活疫苗。如缺失FMDV细胞吸附位点的编码序列或前导蛋白酶的编码序列可得到FMD的减毒毒株,将其作成减毒活疫苗免疫动物可获得较好的免疫效果。(2)研制嵌合疫苗,开发多价疫苗,例如在DEN4感染性克隆的基础上构建型间嵌合体,表达DEN1、DEN2、DEN3的结构蛋白,以此为基础做成多价疫苗,能为实验动物提供保护作用。(3)新型核酸疫苗即RNA疫苗,RNA疫苗克服了DNA疫苗可能引起细胞转化的潜在危险,也解决了DNA疫苗进入细胞核困难、表达量低下的缺陷。因此RNA疫苗是一类很具希望的新型疫苗。(4)利用感染性克隆作为现有减毒活疫苗的种子批,可以减少生产批次间的差异,保持疫苗的稳定性和安全性。
4)RNA病毒载体方面:RNA病毒载体与传统活病毒载体相比,以RNA病毒作为载体具有如下优点:(1)基因组较小利于操作。(2)多数感染哺乳动物的RNA病毒只在胞浆中增殖和转录基因组,引起特异病毒蛋白的高效表达,并且可防止宿主对外源性RNA的核剪切造成的损害。源基因的表达不受宿主的控制,RNA病毒没有DNA相,避免了病毒DNA整合到宿主细胞DNA上。(4)有些正链病毒,其裸RNA基因组转染适当细胞后可作为mRNA直接由宿主内质网翻译成病毒蛋白,这是其作为基因表达载体的关键。(5)宿主谱广,几乎适用于所有的哺乳动物和禽类。例如以黄热病毒骨架表达乙型肝炎病毒prM和E蛋白,可用作预防黄热和乙脑的二联疫苗,也可以表达DE2的prM和E蛋白,能给实验动物提供保护作用。以狂犬病毒为载体,表达人类免疫缺陷病毒l型gag蛋白的病毒能够作为理想疫苗株;以狂犬病毒为载体,增加狂犬病毒自身一个G基因表达的重组病毒,与原病毒相比,对鼠有很强的免疫原性,但致病性降低。以狂犬病毒为载体,表达禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)糖蛋白,可刺激机体产生细胞和体液免疫,以探索以狂犬病毒为载体的新型基因工程疫苗.
26.狂犬病毒的基因组有何特点?如何应用反向遗传操作技术改造狂犬病毒?
答:狂犬病病毒(RV)属于弹状病毒科狂犬病毒属,可引起人和多种动物的狂犬病。其基因组为l2kb左右的单链负股RNA,病毒基因结构为3`-N-P-M-G-L-5`,编码5种功能不同的结构蛋白.即核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和大转录蛋白(L),核蛋白(N)紧紧地包裹基因组RNA,形成核糖核蛋白体复合物(RNP)。大蛋白(L)与磷蛋白(P)是依赖RNA的RNA聚合酶复合体.基质蛋白(M)是RNP与糖蛋白(G)胞浆域的桥梁.G蛋白是病毒的跨膜蛋白,由胞浆域和胞外域2部分组成,可诱导感染动物产生中和抗体,调节病毒的转录与复制,是病毒的主要免疫原蛋白。G、L基因序列之间是一个伪基因.病毒表达蛋白质的水平随着基因组序列3`到5`的逐步转录而减弱。
利用反向遗传技术对狂犬病毒的分子生物学特性的研究包括病毒基因突变与功能的关系研究,基因重排与功能的关系研究,病毒中基因缺失与病毒毒力的关系研究,狂犬病毒表达外源基因的研究等。举例如下:
基因功能研究:为了研究RV的致病基因,Etessami等成功拯救出了G基因的缺失病毒,体外实验发现病毒不能在细胞间传播,感染小鼠后也未发现任何病理性变化。Ito等用RV强毒株Nishigahara将G蛋白基因替换事先构建的弱毒株RC-HL反向遗传学系统中相应基因,制备出嵌合病毒。将该嵌合病毒脑内接种小鼠后,与Nishigahara株一样可以引起小鼠死亡。证明G基因是RV毒力决定基因,也表明G蛋白在病毒吸附过程中具有重要作用。比较RC—HL株和Nishigahara株的G蛋白基因后发现242、255、268位的氨基酸发生了变异。在构建的弱毒株RC—HL反向遗传系统中逐步把242、255、268位的氨基酸替换为Nishigahara株的G蛋白基因,发现任何一个氨基酸被替换后致病性都会增加。将弱毒rHEP株G基因333位氨基酸替换为精氨酸后致病性大大增加。进一步证实G蛋白333位氨基酸是毒力决定位点。这也说明RV的致病机理是很复杂的。
新型病毒载体的构建:Schnell等利用RV反向遗传学操作系统SPBN制备出2株分别表达来源于HIV-1实验室适应株CXCR4tropic和田间分离株dual-tropic的gpl60基因重组复制缺陷RV。将上述病毒接种事先经重组HIV-1gp120蛋白免疫的小鼠后,均可在血清中检测出滴度高达1:800的HIV-1中和抗体。Siler等同样利用SPBN成功地构建了表达丙肝病毒E2蛋白的重组RV,将灭活或者纯化的重组病毒免疫小鼠,可以诱发针对E2蛋白强烈的细胞免疫应答。Smith等将炭疽杆菌的保护性抗原的第四域插入到SPBN株G蛋白基因后的基因区,构建出表达G和炭疽杆菌保护性抗原的嵌合病毒,小鼠实验表明能够产生对RV和炭疽杆菌的保护性抗体。
新型安全疫苗的开发:Faber等构建了含有细胞色素c基因的RV重组病毒,实验证明可以显著增强免疫反应。之后,将RV重组病毒SPBNGA携带了SADB19株的糖蛋白,其中333位的Arg由Glu替代,成年鼠脑内接种后无致病性。此外,插入2个G的重组病毒RVSPBNGAGAN可以起GP的超表达,并且增强细胞的凋亡作用,活体平行试验表明免疫原性增强。Muto等在构建的弱毒株rRc-HL反向遗传学系统基础上构建了双G蛋白R(NPMGGL)株,该弱毒株感染的细胞不但病毒滴度增加而且G蛋白表达量增加了1.5倍,表明免疫效果比rRC—HL株更好。本方向还包括以狂犬病毒为载体,表达人类免疫缺陷病毒l型gag蛋白的病毒能够作为理想疫苗株;以狂犬病毒为载体,增加狂犬病毒自身一个G基因表达的重组病毒,与原病毒相比,对鼠有很强的免疫原性,但致病性降低.以狂犬病毒为载体,表达禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)糖蛋白,可刺激机体产生细胞和体液免疫,以探索以狂犬病毒为载体的新型基因工程疫苗.
21.动物传染性海绵状脑病的发生原因及可能的预防措施。
BSE的病原为朊病毒,对理化因素有较强的抵抗力。外观为淀粉样颗粒,可以多种形式存在,如prpc(正常蛋白酶抗性蛋白)、prpsc('致病性蛋白酶抗性蛋自)。prpsc是由宿主基因编码的,与prpc的区别主要表现于理化性质上:prpsc在用去污剂抽提时,聚集成大分子的纤维样结构(SAF一痒疫相关纤维),且对蛋白酶K不敏感,prpc则相反。prpsc的二级结构与prpc明显不同:prpsc无或少α-螺旋结构,有β-折叠片结构;prpc有α-螺旋结构,无或少β-折叠片结构。现普遍认为,prpsc是由prpc翻译后修饰而来的。prpc的原有功能不明。prpsc有嗜同种性,决定宿主的易感性,且是选择靶神经元群体的分子基础。prp序列保守性和氨基酸特性影响朊病毒种间传播的效率。据推测,prpsc可以指导prpc折叠、组装,通过生物体内部循环,逐渐聚集于大脑、脊髓,破坏神经细胞,使人畜患病,以至死亡。
目前,人类还没有掌握对付BSE的有效疗法,只能采取一些防范措施。英国已于1988年7月18日宣布:禁止使用反刍兽源肉骨粉饲喂反刍兽。欧盟也先后制定了一些政策,对BSE的预防起到了一定作用。2001年4月19日,欧盟科学指导委员会(SSC)再次提出了对BSE的9点意见。我国虽尚未发现BSE,但为了拒之于国门之外,我国于2001年成立了BSE监测中心。但仅有这些显然还不够,还要动员社会各界产加防范。主要措施如下:①增强防范意识,发现疫情后及时上报,妥善处理;②加大防疫力度,严厉打击肉品走私活动,提高我国肉品信誉,保证质量;③严格入境检疫:1996年3月29日,农业部通知要求严防BSE传入我国。2001年3月27日,卫生部、出入境检疫局重申,要加强防范BSE。禁止疫区的动物及其产品入境,对来自疫区的交通工具进行严格的消毒处理。加强对入境货物、邮寄品的检查,对途经或停留我国境内的航班、船只废弃物等做无害化处理;④严把饲料质量关。在饲料生产上要保证消灭病原因子,禁止给反刍动物饲喂反刍动物组织;⑤交换遗传材料(精液、胚胎)方面要注意防范病原因子的引入;⑥一旦发现有可疑病畜即焚毁;⑦加强食品卫生检疫,杜绝经食物链引入BSE;⑧加大研究力度,促进防治朊病毒病药物的研制开发。不久的将来,传染性海绵状脑病将不再是不治之症。
22.动物传染性海绵状脑病如何进行确诊?
BSE的诊断以组织病理学为主,并至少应配合免疫组织化学染色法或西方免疫墨点法或酵素连结免疫吸附分析法等其中一种检验方能进行确诊,兹将已建立之实验室诊断方法详述如后:
  (一)组织病理学诊断法
  将采集的牛脑组织置于10%中性福尔马林液固定完全后,取大脑、小脑及脑干共十个部位的脑组织,其重点部位为延脑(medullaoblongata)成"V"字形尖端的闩(obex),修整为约4mm的厚度,放入脱水包埋盒中,再浸泡于98%的蚁酸中1小时(将具感染能力的prion不活化),然后再浸泡于10%中性福尔马林液中2天。再依一般例行之病理切片方法,将组织块脱水、石蜡浸润、石蜡包埋等步骤,制作成3-5m厚之切片,脱蜡后以H&E染色及封片,于显微镜下观察各部位脑组织切片中的病理变化。经H&E染色之组织切片于显微镜下进行判读,感染BSE牛只在神经病理学上主要呈三个特殊病变为:1.脑皮质灰质部产生空洞状退化。2.神经元细胞坏死及数目减少。3.神经星状胶质细胞增多(astrocytosis),使脑组织呈现海绵样变性(spongiformchange)。若发现上述病变者,则判定为阳性,但仍需进行下列方法以进行确诊。
  (二)免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)
  利用对prion蛋白质特异性的单株抗体及免疫染色技术来达到侦测牛脑组织中的PrPsc为目的。其组织切片制作方法与组织病理学诊断之步骤相同,每次染色需同时染阳性对照切片。组织切片如常规进行脱蜡后,以磷酸盐缓冲液(0.1Mphosphatebuffersolution,pH7.2,PBS)洗3次,置于蛋白K溶液中37℃15分钟。将切片放入不锈钢盒中加入沸水,置于1bar121℃高温高压灭菌器中20分钟后,再以PBS洗3次,然后置于3%双氧水溶液中10分钟,再以PBS洗3次。取出切片,组织周围以无尘拭纸吸干水分,置于保湿盘中,在组织上滴满5%的正常猪血清,于室温20分钟,倒掉血清,在组织上滴满PrP单株抗体(F99/97.6.1,VMRDInc.),置于37℃4小时或隔夜,再以PBS洗3次,在组织上滴满次级抗体(biotinylatedsecondaryantibody,DAKOChemMatedetectionkits),于室温10分钟,以PBS洗3次,在组织上滴满受质(peroxidaseconjugatedstreptavidin,DAKOChemMatedetectionkits),置于室温10分钟,以PBS洗3次,再用蒸馏水洗去盐类,在组织上滴满呈色剂(AECorDABsubstrate,DAKOChemMatedetectionkits),于室温5分钟,用蒸馏水洗。滴上苏木精复染数秒,然后水洗,滴上封片胶,盖上盖玻片,置于显微镜下镜检。
  (三)西方免疫墨点法(Westernimmunoblotmethod)
  采用商品化检测套组(PrionicsR-Check,RocheAppliedScience),其原理主要是侦测脑组织中对蛋白K有抵抗性的PrPsc,因为正常的prion蛋白质会被蛋白K所消化,而不正常的PrPsc对蛋白K具有抗性,只会被部分消化,所以分子量会由32-35kD变为27-30kD。选取延脑的闩(obex)或脑干或大脑灰质部的脑组织,秤重后加入均质液研磨成10倍均质乳剂,取100l乳剂加10l消化缓冲液及10l蛋白K混合均匀后置于50℃加热40分钟,然后加10l消化停止液以终止反应。再加入100lPAGE样本缓冲液混合均匀,加热至96℃5分钟。架设电泳胶片,加入电泳缓冲液于电泳槽内。将待测样本及对照样本各加10l于电泳胶片孔内以200伏特电泳30-45分钟。电泳胶片取出以湿式转渍器来进行转渍(transfer)至PVDF膜上,于4℃150伏特1小时。然后取出膜加入以PonceauS染色2分钟,标示标记分子的大小,然后以TBST(Tris-Buffered-SalinewithTween)脱色。以PVDF阻断缓冲液于室温震荡0.5-1小时,以1:5000倍稀释的单株抗体,置于震荡器上于室温反应1-2小时,然后以TBST洗4次,再以1:5000倍稀释的次级抗体,置于震荡器上于室温反应0.5-1小时,以TBST洗4次。将膜浸泡于Luminescence缓冲液中震荡5分钟,然后加入50lCDP-Star于室温5分钟,然后将膜上的水分吸干,置于透明保护膜内于暗房中放入X光底片上压片,再冲洗底片观察结果。
  (四)酵素连结免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)
  采用商品化检测套组(BSEpurificationkit&PLATELIARBSEdetectionkit,Bio-Rad),此目前最快速且敏感的检测方法,乳剂之制备方法同前,取500l乳剂加500l蛋白K溶液(1mldenaturingsolution+4lproteinaseK)混合均匀,置于37℃10分钟,再加500lclarifyingsolution,混合均匀后离心20000g5分钟,倒掉离心管中的液体,并倒立于吸水纸上5分钟,然后各加50lresolvingbuffer,置于100℃加热5分钟,混合均匀后加入250lsamplediluent。取出检测盘,于孔内分别加入100l阳性对照、阴性对照及待测样品,用胶片封盘,置于37℃感作75分钟。以washingsolution清洗三次,拍干后加100lconjugate,再用胶片封盘,置于4℃感作60分钟,以washingsolution清洗五次,拍干后加100lrevelationsolution,置于室温下之暗室30分钟,加100lstoppingsolution,以450/620nm波长ELISAreader读取结果。
  三、其它诊断方法
  目前BSE的诊断除了前述的四种方法外,陆续可能还有许多更新的检验技术与检验套组会不断地被开发出来,但目前大多仍处于研究阶段未能普遍地被应用于诊断。例如在检验技术方面,有些实验室应用基因转殖鼠(transgenicmice)来进行人工动物接种试验,大幅缩短原先接种小白鼠所需的292天潜伏期,但因实验动物的饲养较费人力,且需在符合生物安全三级的阴压动物舍饲养,所以目前仍只应用于研究领域。
  另外在脑脊髓液的检验方面,由BSE的确诊病例发现,藉由双向电泳分析法(twodimensionalgelelectrophoresis)可侦测出指标性蛋白质apolipoproteinE,但目前尚无法应用于临床诊断,因为这种蛋白质不具特异性,只可作为神经退行性变化的非特异性指标。同样地,从脑脊髓液中侦测14-3-3蛋白质的方法,或是藉由脑脊髓液与血清侦测S-100蛋白质也因特异性低,同样不适用于BSE的诊断。
  至于活体检验部分,目前只有利用免疫组织化学染色法应用于羊搔痒症之扁桃腺与眼瞬膜进行活体检验,但是根据实验接种牛的结果发现,不仅在潜伏期,甚至在临床发病期都无法从淋巴组织侦测到具有感染力的prion,故不能应用于BSE的诊断,所以目前仍有许多学者正在积极地研发其它活体生前的检验方法。
  亦有学者藉由电子化学分析法(electrochemicalanalysis)侦测感染prion动物尿液中的代谢物,但是这种方法的敏感性和特异性较低,目前仍不建议用作单一的诊断法。
  在检验套组方面,目前除了前述商品化的免疫西方墨点法与酵素连结性免疫吸附法检验套组之外,目前较新的检验套组同样是利用ELISA的原理,只是改用冷光(chemiluminescence)来呈色以提高其敏感性与特异性。虽然新的检验技术不断地推陈出新,但是由于许多新的检验方法缺乏真实之黄金诊断标准(truegoldstandard),而且因为随着潜伏期的不同对前述检验方法的敏感性也有所不同,若是要应用在诊断仍需再评估。根据国际畜疫会的建议,若是在发生率低的地区或是非疫区的监控仍是以组织病理学诊断与免疫组织化学染色为主。
1我国人畜共患传染病的流行特点?
1、老的疾病未完全控制,新的疾病又不断出现:我国建国以来只消灭了两种传染病。据农业部1986-1990年对畜禽疫病进行普查的结果,我国畜禽传染病有202种,且新疫病不断出现,如80年代以来新发现的疫病就有17种,其中传染病15种,寄生虫病2种。
2、老病出现新症状,老病原出现新变异:病原因子在环境压力与机体免疫压力下,不断发生变异,出现新的变异株与血清型,如口蹄疫、禽流感、猪流感、鸡传染病性支气管炎等,病原因子毒力变异导致新的流行,甚至造成灾难性的后果。如禽流感对哺乳动物的毒力增强,导致人的感染。与此同时,使一些烈性传染病病原出现非典型感染与发病,如目前流行的非典型性新城疫与非典型猪瘟,给疾病的控制与消灭带来极大的困难。
3、多病原并发、继发使疾病复杂化:临床发病动物常能检测出多种病原,如猪伪狂犬病病毒与细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪II型圆环病毒等呈混合感染,给疾病的诊断、预防和控制增加难度,经济损失巨大。
4、细菌性疾病危害加剧:随着集约化养殖的规模不断扩大,污染日益严重,细菌性疾病明显增多,如猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、链球菌、大肠杆菌等细菌感染的危害已变得十分严重。滥用抗生素等导致耐药菌株普遍存在,并使一些体内正常菌群成为致病菌群。同时由于临床大量使用抗生素,造成产品药物残留含量增加、产品质量下降、出口受阻,消费者心里恐慌。
5、人畜共患传染病问题突出:人畜共患传染病对我国人民健康和畜牧业发展的影响更大,尤其是近年来可以说是深受其害。如2003突如其来的SARS和2004年爆发的禽流感,其造成的政治、经济、社会的影响人们还记忆犹新和心有余悸。除此之外,我国无论是猪还是人都是世界上乙型脑炎发病和死亡最高的国家。狂犬病已夺去了我国数万人计的生命。随着我国奶牛业的快速发展,奶牛结核病严重威胁着我国人民的健康,耕牛和人的血吸虫病死灰复燃,猪普遍携带戊型肝炎病毒,导致人的戊肝爆发和散发,猪弓形体、衣原体病等也严重影响人类的健康。动物传染病不仅严重威胁着人民生命财产安全,而且也给国家带来沉重负担。
6细菌的耐药性越来越严重,
7部分疫病的发生呈不典型性趋势,由于疫苗的使用(非典型性猪瘟等)
8随着经济全球化,人们间的流通加快,疫病在传播速度也随之加快
9病毒变异速度加快,部分病毒突破种间屏障

1. 寄生虫的分类和生活史
答:(1)分类
自从采用林奈的双名法对寄生虫进行命名以来,主要的分类依据是形态学、生活史、流行病学、生理与生化等方面的特征。在同一群体内,其基本特征,特别是形态特征是相似的,这是目前寄生虫分类的重要依据。进化则是寄生虫分类的基础。所有的动物(种)都属于动物界,又依各种生物之间相互关系之密切程度,分别组成不同的分类阶元。寄生虫分类的最基本单位是种,近缘的种归结到一起称为属,近缘的属归结到一起称为科,依次类推,有目,纲,门,界,进一步细分时,还可有亚门,亚纲,亚目,超科,亚科,亚属,亚种或变种等。分类轮廓如下。分类的标准随寄生虫种类而有所变化。节肢动物寄生虫的分类依据主要是骨骼的形态;吸虫和绦虫的分类很大程度上基于生殖器官的数量、大小和在体内的相对位置;线虫的分类则必须关注生殖器官的结构,尤其是雄虫身体末端的结构形态,但感觉乳突和其他的表皮特征,尤其口孔周围的构造也应考虑在内;原虫的分类特征包括卵囊的形态(阿米巴原虫、球虫)、鞭毛的数量和排列及生物化学特性。

(2)生活史
举例说明各类蠕虫(吸,线,绦,棘头)原虫(球,血孢子,鞭毛,纤毛)和节肢动物(蜱螨昆虫)的生活史特点。
线虫
线虫的生殖方式有卵生,卵胎生和胎生三种。从诊断、治疗和控制的角度出发,可将线虫生活史分为四个期间:成虫期,感染前期,感染期,成虫前期。各期间之间的阶段分别称为污染,发育,感染和成熟。线虫的发育过程一般都要经过五期,中间有四次蜕化;幼虫一般经一次或两次蜕皮后才对终宿主有感染性(或称侵袭性);如果感染性幼虫仍在卵壳内不孵出,称之为感染性(或侵袭性)虫卵;如果幼虫已从卵壳孵出,则称为感染性(或侵袭性)幼虫。
根据线虫在发育过程中要不要中间宿主,可分为无中间宿主的直接发育型线虫和有中间宿主的间接发育型线虫。
土源性线虫:幼虫在外界环境中,如粪便和土壤中直接发育到感染阶段;
生物源性线虫:幼虫需在中间宿主如昆虫和软体动物等的体内才能发育到感染阶段。
吸虫
寄生性的复殖吸虫生活史为需要宿主交替的较为复杂的间接发育型,中间宿主的种类和数目因不同吸虫种类而异。主要特征是要更换一个或两个中间宿主。第一中间宿主为淡水螺或陆地螺,第二中间宿主多为鱼,蛙螺或昆虫。复殖吸虫生活史虽较复杂,但基本生活史类型包括卵、毛蚴、胞蚴、雷蚴、尾蚴、囊蚴、与成虫。卵从成虫所寄生的器官排进宿主腔道并随排泄物排出体外,在水中孵出毛蚴或被宿主吞食后才孵出毛蚴。毛蚴侵入螺蛳淋巴系统或其它器官发育为胞蚴。胞蚴体内胚团分裂发育成多个雷蚴。雷蚴中的胚团再分裂发育为多个子雷蚴。雷蚴与子雷蚴中的胚团分裂发育为尾蚴。在不利环境,如寒冷季节,有些吸虫的雷蚴不产生尾蚴而只产生雷蚴,并可连续数代。在血吸虫也可见类似情况:子胞蚴不产生尾蚴而产生胞蚴。这种变换生殖现象称为多胚繁殖。有些吸虫缺雷蚴期或囊蚴期,而另一些吸虫却具有两代以上的雷蚴期。吸虫的感染期是尾蚴或囊蚴。囊蚴随其附着物或第二中间宿主进入终宿主的消化道内,囊壁被胃肠的消化液溶解,幼虫即破囊而出,经移行到达寄生部位,发育为成虫。部分以尾蚴为感染期的吸虫需移行才能到达适宜发育的定居部位。不同器官组织为虫体提供不同发育期所需的营养物质,虫体能识别不断改变的连续刺激,使大部分虫体能按一定移行途径到达定居部位。不适宜宿主不能提供必需的营养物质及生理信号,因而出现异常的个体发生移行,导致异常寄生或发育迟缓甚至死亡。
绦虫
大多数的绦虫的发育需通过一到二个中间宿主才能完成其整个生活史,其中间宿主多种多样,有软体动物、节肢动物和脊椎动物等。成虫均为雌雄异体,其在终末宿主体内的受精方式大多数为自体受精,也有异体受精或异体节受精的。绦虫幼虫在中间宿主体内的发育可分为五个时期:1.六钩蚴期;2.原腔期;3.囊腔期;4.头节形成期;5.似囊尾蚴期或囊尾蚴。
(1) 假叶目绦虫生活史特点:假叶目绦虫的子宫向外开口,虫卵可从子宫排出孕节外,随终末宿主粪便排出外界,排出体外时对中间宿主不具有感染性,只有经过在水中发育后才能形成成熟的六钩蚴。一裂头绦虫为例,六钩蚴被第一中间宿主剑水蚤吞食后,在剑水蚤的血腔发育为原尾蚴。含有原尾蚴的剑水蚤被第二中间宿主鱼、蛙、蛇及多种哺乳动物吞食后,就逐渐发育变为实尾蚴,含有实尾蚴的第二中间宿主组织被相应的终末宿主(如犬、猫、狼、狐狸等)吞食后,在终末宿主的消化道内经消化液左右,蚴体逸出,吸附在肠壁上,组建发育为成虫。
(2) 圆叶目绦虫生活史特点:圆叶目绦虫的子宫不向外开口,成熟的虫卵随着孕节脱落,在终末宿主肠道排出过程中的机械作用下或排出体外节片破裂后才能释放出来。虫卵被适宜的中间宿主吞食后,卵内的六钩蚴孵出,通过不同的途径及方式到达寄生部位,并发育成为具有某种形态特征的中绦期(囊尾蚴和似囊尾蚴两种类型)。终末宿主吞食了含有似囊尾蚴或囊尾蚴的中间宿主组织后,在胃肠内经消化液作用,蚴体逸出,头节外翻,吸附在肠壁上,逐渐发育为成虫。
棘头虫
生活史特点:雌雄异体交配受精。发育需要中间宿主,为甲壳类动物和昆虫,排到自然界的虫卵被中间宿主吞咽后在肠内孵化,其幼虫钻出肠壁固着于体腔内发育,先变为棘头体而后变为感染性幼虫—棘头囊。终末宿主因摄食含有棘头囊的节肢动物而感染。在某些特殊情况下其生活使中可能有搬运宿主或储藏宿主,往往是蛙蛇或蜥蜴等脊椎动物。
原虫
生活史特点:
主要呈两性世代交替进行,无性繁殖主要以二分裂;复分裂;孢子生殖;出芽生殖的方式进行。有性繁殖首先进行减数分裂,由双倍体转变为单倍体,然后两性融合,再恢复双倍体。主要由配子生殖和接合生殖两种类型。(1)通过直接或间接方式由感染者传播至易感者的原虫 此类原虫生活史简单,完成生活史只需一个宿主。但有二种情况:¬整个生活史只有一个发育阶段,即滋养体。此阶段对外界的抵抗力较强,一般以直接接触的方式传播,如阴道毛滴虫;­生活史有滋养体和包囊两个阶段,滋养体具有运动和摄食功能,为原虫的生长、发育和繁殖阶段;包囊则处于静止状态,是原虫的感染阶段。一般通过饮水或食物进行传播。如溶组织内阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫即属于此种类型。(2)通过循环方式传播的原虫此类原虫在完成生活史和传播过程中,需要一种以上的脊椎动物宿主作为终末宿主和中间宿主,其感染阶段可在二者之间进行传播。不需要无脊椎动物宿主。如刚地弓形虫,可在终末宿主(猫或猫科动物)和中间宿主(人和多种动物)之间传播。(3)通过媒介昆虫传播的原虫此类原虫只有在媒介昆虫体内才能发育至感染阶段。如不同种的疟原虫,只有在相应媒介蚊种吸血时将其吸入体内,最终发育成感染阶段—子孢子才能感染人体。
节肢动物(蜱螨昆虫)
生活史特点:1。属不完全变态:卵—幼虫---若虫---成虫,有1-7个若虫期。2。有一定的HO和寄生部位特异性。3。寻找HO吸血有时间性,硬蜱多白天,软皮,刺皮螨多夜间。4。生活方式因种而异,有兼性有专性。5。生活周期因种而异,螨类为8-22天,蜱类为一个月至一年左右。虫体发育速度直接受外界环境的引响。

2. 日本血吸虫的防控
答:1.消灭传染源人畜同步化疗是控制传染源的有效途径。吡喹酮是当前治疗血吸虫病的首选药物,具有安全有效,使用方便的特点。人群化疗措施分为全民化疗,选择性化疗和高危人群化疗三种。各地可根据当地的流行程度,因地制宜。
  2.切断传播途径
  (1)灭螺:灭螺是切断血吸虫病传播的关键,主要措施是结合农田水利建设和生态环境改造,改变钉螺孳生地的环境以及局部地区配合使用杀螺药。目前世界卫生组织推荐使用的化学灭螺药为氯硝柳胺。在短期内不易消灭钉螺的湖沼洲滩地区,采用建立“安全带”的方法,即在人畜常到的地带(称易感地带)反复灭螺,以达到预防和减少感染的目的。
  (2)粪便管理:感染血吸虫的人和动物的粪便污染水体是血吸虫病传播的重要环节,因此,管好人、畜粪便在控制血吸虫病传播方面至关重要。由于人尿和尿素分解后产生的氨能杀灭虫卵,因此采用粪、尿混合贮存的方法杀灭粪便中的虫卵,有助于控制血吸虫病的传播。
  (3)安全供水:结合农村卫生建设规划,因地制宜地建设安全供水设施,可避免水体污染和减少流行区居民直接接触疫水的机会。尾蚴不耐热,在60度的水中会立即死亡,因此家庭用水可采用加温的方法杀灭尾蚴。此外,漂白粉、碘酊及氯硝柳胺等对尾蚴也有杀灭作用。
  3.保护易感者人类感染血吸虫主要是人的行为所致。加强健康教育,引导人们改变自己的行为和生产、生活方式,对预防血吸虫感染具有十分重要的作用。对难以避免接触疫水者,可使用防护药、具,如穿长统胶靴、经氯硝柳胺浸渍过的防护衣或涂擦苯二甲酸二丁酯油膏等防护药物。由我国学者自行研制的青蒿素衍生物蒿甲醚和青蒿琥酯对童虫有很好的杀灭作用,对已接触过疫水者,在接触疫水后第7天至第10天服用青蒿琥酯,成人每次服300mg,儿童按6mg/kg体重计算,以后每周服用1次,离开疫水后再加服1次,可达到早期治疗的目的。
血吸虫病的防治是一个复杂的过程,单一的防治措施很难奏效。世界卫生组织针对血吸虫病防治工作于1984年提出了人畜化疗结合健康教育,辅以局部或季节性灭螺的策略。目前我国防治血吸虫病的基本方针是“积极防治、综合措施、因时因地制宜”。积极防治是指积极治疗病人和开展各种预防措施,综合措施是指治疗病人、病畜、灭螺、防护、粪管、水管及宣传教育同时进行的措施,因时因地制宜是指在不同类型流行区,根据不同的流行因素,采取不同的防治策略,如在钉螺难以控制的湖沼地区和大山区,采取以化疗为主导和有重点的消灭钉螺,而不是强调以消灭钉螺为主的综合措施。

1.RNA干涉的原理,在寄生虫方向的应用前景及意义。
RNA干涉的原理:
当病毒基因,人工转入基因,转座子等外源性基因随即整合到宿主细胞基因组内,,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些双联RNA(dsRNA)。宿主细胞对这些dsRNA迅速产生反应,其胞质中的DicerRnaseL将dsRNA切割成具有特定长度和结构的小片段RNA(siRNA)。由于siRNA与外源基因表达的mRNA进行特异性结合,并诱发宿主细胞对这些mRNA的降解反应,是外源性基因的蛋白表达消失。RNAi发生于除原核生物以外的所有真核细胞内。

在寄生虫方向的应用前景及意义:
大多数寄生虫不适合用来做遗传分析,RNAi技术的应用将会起到很大作用。寄生虫的RNAi干涉机制和植物及果蝇很相似,所以这项技术不但能取代传统研究功能基因组的方法,而且能够为更快的了解基因功能提供一个有利的依据。(功能基因的研究,药物靶位和疫苗靶位的选择,基因敲除)

在秀丽新杆线虫的研究中,用RNAi方法研究之前,仅有约9%的秀丽新杆线虫基因在生化或遗传水平进行了研究,但是采用了这项技术之后,至少阐明了已有三分之一的秀丽新杆线虫基因的功能。deMoraes等(2009)指出,RNAi技术在功能基因的研究中已成为重要的工具,但仅对基因独特性表达的血吸虫比较适用,在目前已经研究的32个基因中,包括抗氧化基因,转录因子,细胞信号传导分子,代谢酶等的编码基因。血吸虫早期在螺内的发育,可以通过RNAi的基因敲除以及形态学上表型的改变来研究。转录本的选择来源于体外培养的曼氏血吸虫的胞蚴。毛蚴在存在dsRNAs的培养液中培养七天后成为胞蚴。这时可以观察到明显的表型变化,包括活力的下降,生长的改变和死亡。dsRNA处理的结果是产生一致的表型改变或基因表达水平的改变。尽管RNAi对功能基因的研究起到非常重要的作用,但是在这项研究中,某些dsRNA处理时有非特异性的影响,在特殊基因敲除后展示出不确定的效果。这将为今后实验设计的优化,实行和数据处理带来依据。除此之外,RNAi还在阿米巴,毛滴虫等寄生虫研究中得以应用。
RNAi技术将在功能基因组学研究,抗病毒感染,疾病基因治疗等领域发挥越来越重要的作用。
2.线粒体基因组和核基因组的不同?
线粒体基因组:
线粒体基因组(mtDNA)呈环状,大小在13~20kb之间
含有36~37个基因,包括22个tRNA基因,2个rRNA基因(rrnL,rrnS),12~13个蛋白质基因(全是细胞内呼吸链酶复合体组成部分,包括cox1-3,cob,nad1-6,nad4L,atp6,atp8)。
mtDNA中还含有一段非编码区(D-环、AT富集区或者调控区),该区域参与动物mtDNA的复制与转录的调控
mtDNA小,它所在的细胞器与细胞凋亡(与整个机体的衰老)有关
mtDNA的遗传密码、密码子使用、tRNA的结构等方面与核基因组不同
进化比核基因组快,有较高的突变率,母性遗传
线粒体基因组非常适合用来作遗传研究的marker
与动物进化、动物群体遗传、动物系统分类以及由线粒体基因突变引起的各种疾病都有广泛而深远的意义。
核基因组:
 核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内,除配子细胞外,体细胞内的基因的基因组是双份的(即双倍体,diploid),即有两份同源的基因组。
  核基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。
  存在重复序列,重复次数可达百万次以上。
  基因组中不编码的区域多于编码区域。
  大部分基因含有内含子,因此,基因是不连续的。
  基因组具有许多复制起点,而每个复制子的长度较小。
根据我国当前ND流行的现状论述我国在预防控制ND方面应采取的科学策略
防治措施
在实际生产中除了良好的疫苗免疫外,做好充分的防治措施,才能更好地防治新城疫,减少经济损失。
2.1切实提高工作人员的素质,对于养禽厂来说,努力提高从业人员的科学文化水平和饲养管理水平,对无论是禽群疾病的防治还是该场的长远发展都有着重要的意义。
2.2优化饲养场的环境条件,建立生物安全体系。加强鸡场环境内外的消毒,防止各类病原,如免疫抑制病的暴发。进行全进全出的饲养管理,不同日龄、不同品种和不同种类的家禽应隔离饲养。
2.3选用合适的疫苗,制定合理的疫苗免疫程序,不能过多的免疫或是免疫次数不足而造成疾病的暴发。免疫方面,为提高免疫效果,弱毒苗采用点眼滴鼻能有效提高局部免疫力。ND免疫程序的制定和实施受许多因素的影响,故只能根据本地和本场的实际情况来制订,然后在实践生产中进行补充和完善。
2.4密切留意鸡群的免疫效果和进行抗体的监测,生产中科学地对鸡群进行抗体监测才能有效地控制新城疫的流行和暴发。
2.5发病后的应对措施:早发现早确诊,严格封锁发病鸡舍或鸡场,进行全场的紧急消毒,扑杀发病鸡,根据情况对健康鸡群紧急接种疫苗(一般可采用5-10倍Ⅳ系疫苗做肌肉注射接种),饲料中可添加多种维生素和抗菌药物以减轻细菌继发感染造成的损失

2.农业部发布的动物疫病分级中几种水生动物的重要疾病
 一类水生动物疫病:鲤春病毒血症,白斑综合征
 二类水生动物疫病:鱼类病(11种):草鱼出血病、传染性脾肾坏死病、锦鲤疱疹病毒病、刺激隐核虫病、淡水鱼细菌性败血症、病毒性神经坏死病、流行性造血器官坏死病、斑点叉尾鮰病毒病、传染性造血器官坏死病、病毒性出血性败血症、流行性溃疡综合征
  甲壳类病(6种):桃拉综合征、黄头病、罗氏沼虾白尾病、对虾杆状病毒病、传染性皮下和造血器官坏死病、传染性肌肉坏死病
三类水生动物疫病:鱼类病(7种):鮰类肠败血症、迟缓爱德华氏菌病、小瓜虫病、黏孢子虫病、三代虫病、指环虫病、链球菌病
  甲壳类病(2种):河蟹颤抖病、斑节对虾杆状病毒病
  贝类病(6种):鲍脓疱病、鲍立克次体病、鲍病毒性死亡病、包纳米虫病、折光马尔太虫病、奥尔森派琴虫病
  两栖与爬行类病(2种):鳖腮腺炎病、蛙脑膜炎败血金黄杆菌病
3.水生动物疾病研究的概括
目前水生动物疫病呈现以下特点:发病的水产动物品种多;病原种类增多,据不完全统计,人工养殖的水生经济动植物的疾病在200种以上;致病因子日趋复杂,涉及到水域环境、种质、饲料、管理、渔药使用等多因素;防治难度越来越大,如水产动物病毒病,来势猛,传染快,目前尚未找到有效的防治方法。水生动物疾病发病区域越来越广,发病频率趋高,发病期延长。据不完全统计,全国每年发生中等程度以上的养殖病害面积占养殖总面积的20%以上。长期以来我国水产病害控制主要依靠使用各种农药及抗生素等;正自主开发研究的疫苗种类54种;涉及病原27种;8种疫苗进入田间试验阶段,23种处于实验室研究阶段,23种疫苗处于基础研究阶段。

4.虹彩病毒的感染范围
虹彩病毒是一类正二十面体结构的大型单股线性双链DNA胞浆病毒,DNA链具有末端冗余及环状变换现象(独特性),脊椎动物虹彩病毒基因组DNA被高度甲基化
属 宿主种类 代表种 临床症状
虹彩病毒属
 无脊椎动物(主要为昆虫,可能还有甲壳类和软体动物) 二化螟虹彩病毒
 当体内蓄积大量的病毒时使得昆虫体色改变,潜伏感染比较普遍。
绿虹彩病毒属
 带喙伊蚊和摇蚊 带喙伊蚊虹彩病毒
 同上。
蛙病毒属
 鱼类、两栖类和爬行类 蛙病毒3型
 全身性感染,感染的动物从无明显临床症状到近100%的爆发性死亡。
淋巴囊肿病毒属
 鱼类 淋巴囊肿病病毒1型
 鱼体表皮生瘤状囊肿,并不致死,出现厌食症状。
肿大细胞病毒属
 海水及淡水鱼类 传染性脾肾坏死病毒
 全身性感染,感染的脾等器官内细胞异常肿大,发病致死率达100%。

1.根据我国当前ND流行的现状论述我国在预防控制ND方面应采取的科学策略。
1当前ND的发病特点
1.1发病禽种的多样性
检出感染ND病毒发病不仅限于鸡、火鸡,已广泛染于鹌鹑、鸽、珍禽、鸭、鹅和人工驯养的多种野禽。
1.2发病季节性和日龄
一般从3月中下旬开始,6、7月份增多,8月份有所减少,至10月份回升,11、12月份逐步降低,即多发于气候温和的春秋季节。从发病日龄看,雏鸡比成年鸡的易感性高,尤以二免前后的日龄即20~30d之间的鸡群发病最多,其次为50~90d即于肉用鸡群将出售期间或疫接种之际容易发病。
1.3发病症状和病变的非典型性
所确诊的ND大多在临床和病理学上常不表现特征性病变。中、雏鸡发病时以表现呼吸困难和排黄褐色稀便为主,病程稍长时部分出现歪头、扭颈、角弓反张、转圈等间歇性神经症状,剖检时主要为喉头、气管有多量粘液和粘膜表面充出血、水肿,硬脑膜下呈树枝状充血、出血点,约30%鸡腺胃乳头粘膜有少量出血点,小肠呈卡他性炎症,大多缺乏典型ND特征病变。产蛋鸡感染ND后,发病率和死亡率有很大差异,约在5~85%。轻者仅表现一过性的食欲减少,产蛋率下降20~30%。同时,软壳蛋、畸形蛋增多。重者表现精神沉郁、嗜眠、食欲废绝、呼吸困难、黄褐色下痢。病理变化为喉头、气管粘膜出血,腹膜炎、盲肠扁桃体肿大或有出血点,直肠、泄殖腔粘膜出血性溃疡,个别病例腺胃有少量出血点,硬脑膜下有出血点。
1.4发病的散发性和反复性
在养鸡较集中的市县、乡镇、村养殖区域,由于中、小散养户较多,且各养户禽种来源不一,免疫程序不一,鸡群健康状况不一和防疫措施不一等,使ND免疫经常达不到应有效果,仍有不同程度的散发病例或局部范围内的流行。同时,因地面放养场发病后难以采取彻底的消毒隔离措施
2.防治措施
2.1严格执行综合性的防疫措施
要防止ND的发生,必须采取增强鸡群抵抗力、消灭传染源、切断传播途径的基本措施。但实际生产中,许多养鸡户(场)更注重疫苗接种而忽略了其他基本环节。预防接种只能保护鸡只个体和降低鸡群发病率,达不到消灭传染源的作用,更不能消灭污染环境中的ND病毒。因此,应继续提倡和坚持综合防治、鸡舍内外勤消毒、严防人员进出和清洁卫生等。
2.2正确选用疫苗、制定科学的免疫程序
不同种类的疫苗,其免疫原性不同。弱毒活苗中Lasota苗比Ⅱ系苗好,已在实际生产中广泛应用。I系苗由于毒力较强,易排毒污染环境等因素而被免疫原性更好、安全性更高的灭能油乳剂苗取代。同种疫苗不同的免疫方法可以影响免疫效果。试验证明:点眼法最佳,滴鼻法与点眼法相似,但无点眼法免疫确实。肌肉注射法次之,饮水法最差,气雾免疫法在广大农村养户因技术掌握困难较少使用。灭能油乳剂苗只能用皮下或肌肉注射法。合理的免疫时间也是免疫成败的关键。在有条件的养鸡场或养殖区域应建立ND抗体水平监测制度,根据批次雏鸡母源抗体或免疫之后鸡群的抗体水平消长情况,制定科学的免疫程序,实行适时有效免疫。一般认为HI效价在(log2)23(1:8)时,不能保护鸡群免受野毒的侵袭,是界定免疫水平的临界点。对无免疫监测条件的大多数养户,应规范引种渠道,了解种禽场免疫情况。建议饲养期2月龄的肉用鸡群采用Lasota苗于9~16日龄首免,间隔15~20天进行二免。若饲养期超过3月龄或青年产蛋鸡还须在二免后20~25天实行三免。或建议于弱毒苗首免时皮下注射0.25ml灭能苗,保护期可达70~120天。在受ND威胁地区可于50~60日龄左右用Lasota苗加强免疫一次。
2.3实行科学的饲养管理
优质全价饲料、良好的通风、卫生环境、制度化管理不仅有利于鸡群健康,而且增加鸡群的抵抗力。为了提高疫苗免疫后对体内合成抗体和细胞免疫能力,在免疫前后1~2周通过倍量添加多维尤其维生素A、E、D3和K,提高1~2%蛋白质含量,可以明显疫苗的免疫效果。
2.4发生疫情及时处理
ND疫情发生后应立即封舍(场),对全场鸡群及场(舍)内外环境每周1~2次带鸡消毒和环境消毒,对污物和病残鸡进行无害化处理。对疫情急、传染快、呈典型性ND鸡群进行紧急接种I系苗或肌注高免卵黄抗体液,如是缓发型疫情,通过肌肉或皮下接种Lasota苗2~3头份,可以达到良好的防治效果。

5.圆环病毒国内外研究进展
猪圆环病毒(PCV)是目前兽医学发现的最小无囊膜单股DNA动物病毒粒子,根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列,将PCV分为PCV1和PCV2两个型,PCV1对猪为非致病性的,PCV2与猪的很多疾病综合征有关。这些疾病综合征由多种诱因共同导致,其中肯定包括PCV2,但仅有PCV2并不足以引起发病。
1. PCV2的感染与机体的免疫保护作用方面
KekarainenT等用PCV2类病毒粒子(virus-likeparticles,VLPs)和16种新的寡聚核苷酸序列包括CpG基序列(CpG-ODNs)在对猪PBMC和BMDC中IFN-α、IFN-γ、IL-10、IL-2、IL-12水平的变化情况进行了研究,结果表明CpG-ODNs或VLPs并不能够诱导PBMCs中IL-10的分泌。但研究中的绝大多数CpG-ODNs通过回忆抗原使IFN-γ和IL-2分泌受到抑制,而VLPs并没有类似的效应。在BMDC中PCV2和绝大多数CpG-ODNs能够通过PRV抑制IFN-a的分泌,有趣的是CpG-ODNs的这种抑制效应被定位在PCV2Rep基因上。另外,PCV2病毒具有很强的诱导IL-12分泌功能。因此,PCV2感染后对免疫反应的调节作用最终取决于病毒DNA和宿主免疫系统的结构蛋白之间的平衡。
2. PCV2感染与机体免疫系统的相互作用
在体外对健康的和PMWS感染猪的外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)进行研究表明,PMWS感染猪外周血单核细胞产生细胞因子的功能受到明显的、特异性的影响。对PCV2感染有关的淋巴细胞缺失和免疫缺陷的机制研究较少。一些研究者指出细胞凋亡是淋巴结中B细胞减少的机制。AnaR等的研究有力地证明了在PMWS的病程中的淋巴损伤不具备凋亡的特征。此外,有证据表明,在胸腺和次级淋巴器官里,淋巴细胞增殖可以被抑制。这些研究表明PMWS感染猪的淋巴组织中的特征性损伤中细胞凋亡并不是产生这种损伤的重要机制。
3.PCV-2感染与细胞因子的作用
DarwichL等发现,感染PCV2的猪胸腺和扁桃体中的IL-10和IFN-γmRNA的量有所增加,而淋巴细胞中IL-2,IL-4,IL-10,IL-12和IFN-γ的mRNA水平有所下降,但其IL-1β和IL-8的mRNA水平却上升。表明PCV2可以导致T细胞免疫抑制。SiposaW等用半定量RT-PCR和流式细胞仪分别从mRNA水平和蛋白质水平检测了几种细胞因子表达量的变化。半定量RT-PCR结果表明,IL-1α和IL-10mRNA在感染猪体内明显上升,而IL-2和IL-2Ra(CD25)的mRNA却下降,IL-8,TNF-α和IFN-γmRNA则轻微上升。MeertsP等发现IFN-γ可以增强PCV2在PK-15细胞系和3D4/31细胞系的感染和增值。
4猪圆环病毒疫苗研究
4.1PCV2灭活疫苗
2006年4月法国进行的大规模生产研究显示,大约对40万头母猪接种了这种疫苗之后,断奶仔猪的死亡率从4.4%降到了2.5%,育肥猪的死亡率从6.6%降到了5.1%,在死亡率下降的同时PMWS临床发病率也下降了[22]。德国也获得了同样的正面结果。然而必须指出,PCV2疫苗是2004年才开始使用的,此时这些国家(法国和德国)当中PMWS的疫情与1998—2002年间相比已不那么明显。
4.2弱毒疫苗
Fenaux等将PCV2分离株在PK-15细胞中连续传至120代,发现第120代病毒(PCV2VP120)基因组中发生了2个碱基突变,并且都位于Cap基因内,第1个突变发生于第30代病毒,该突变使核衣壳蛋白中第110位的脯氨酸变为丙氨酸,并且在以后的传代中一直维持;第2个突变发生于第120代,使Cap蛋白中第191位的精氨酸变为丝氨酸。将PCV2VP120和PCV2VP1感染SPF猪进行比较,发现PCV2VP120感染后的病毒血症发生率低于PCV2VP1,同时病毒血症的持续时间短,血清中PCV2基因组拷贝量、眼观病变及组织学病变也较PCV2VP1感染猪轻,表明体外传代可增强PCV2在细胞中的繁殖能力,弱化其致病性,为研制PCV2疫苗提供了一个新的思路。
4.3基因工程疫苗
4.3.1核酸疫苗
ShenHG等以质粒ORF2和Cap作为DNA和亚单位疫苗免疫小鼠结果表明,pORF2和Cap的表达产物都能够引起CD4(+)T细胞免疫应答反应,但pORF2的引起的CD8(+)T细胞免疫反应程度要比Cap的强。病毒中和试验表明,pORF2引起的中和病毒(VN)回忆抗体对PCV2反应程度也要比Cap的强,通过实时荧光定量PCR和组织病理学分析,pORF2免疫的鼠,病毒滴度显著降低,免疫损伤轻微。在抗PCV2感染中,CD8(+)T细胞和VN抗体反应主要是和特异性Cap蛋白IgG2相关。pORF2诱导的免疫性保护作用效果要明显强于PCV2Cap蛋白的保护作用。
4.3.2重组疫苗
Fenaux等构建了PCV1和PCV2相互嵌合的感染性克隆,发现减毒的PCV12嵌合感染性克隆可诱导机体产生免疫保护,抵抗PCV2野毒株的攻击。LiuLJ等利用重组的杆状病毒把PCV2Cap基因插入到昆虫细胞Tn5中,结果发现,Tn5细胞能够表达一种分子量大小为28ku,浮力密度为1.365g/cm3,直径为20nm的类PVC蛋白(PVCLps),由于PVC-Lps能够与PVCIgG发生特异的结合,鉴于PVC-Lps具有与PCV2相似的抗原性。因此,PVC-Lp有望成为理想的PCV2候选疫苗。
4.3.3活载体疫苗
SongY等[27]将PCV2ORF2基因插入pIECMV质粒与伪狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞产生一个重组的Tk-/gE-/ORF2(+)病毒。用该重组病毒免疫4周龄的仔猪,采用PRV-ELISA,PRV中和试验,ORF2ELISA和ORF2特异性的淋巴细胞增值试验等方法检测了PRVTk-/gE-/ORF2(+)的免疫原性,结果表明,PRVTk-gE-/ORF2(+)诱导了明显的抗PRV和PCV2体液免疫反应并且在试验的49d能够检测到PCV2特异性的淋巴细胞增值反应。Wang等用表达PCV2ORF2的重组腺病毒免疫小鼠证实了能够有效预防了PCV2相关疾病的感染。

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